重組人胰島素類似物的HPLC分析

目的：探討HPLC分析在重組人胰島素類似物鑒別和雜質檢測中的適用性。方法：采用反相色譜柱(C18)，以硫酸鈉-磷酸緩沖液(0.2mol.L-1，pH2.3)和乙腈為流動相，流速0.8或1.0mL.min-1，柱溫40℃，檢測波長214nm；用分子篩柱(ZorbaxGF250)以磷酸銨緩沖液(0.1mol.L-1，pH7.5)和乙腈為流動相，流速0.5mL.min-1，檢測波長214nm；檢測重組人胰島素類似物及其酶解片段。結果：獲得胰島素及其類似物的RP-HPLC圖譜，肽圖譜和體積排阻色譜(HPSEC)圖。結論：本文方法能夠有效地區(qū)別和檢測胰島素類似物及有關物質，為該類藥物的質控提供了科學依據(jù)。

　　關鍵詞：重組人胰島素類似物肽圖譜反相液相色譜體積排阻色譜

　　重組人胰島素類似物(rhInsulinlispro)是重組人胰島素分子B鏈上第28位的脯氨酸和第29位的賴氨酸位置互換產物。其降血糖作用更迅速。臨床上作為快速降糖藥物，其制劑的商品名為優(yōu)泌樂(HumalogTM)，該藥已被FDA批準上市，并進口我國。在藥品檢驗中，如何區(qū)分一級結構僅有微小差別的人胰島素和人胰島素類似物，本文試用RP-HPLC法和HPSEC法對其分子或酶解片段進行了分析。

　　1、儀器與材料

　　1.1儀器島津LC-10AD泵、CTO-10A柱溫箱、SPD-10A檢測器、DGU-4A脫氣機、C-R7Aeplus積分儀。

　　1.2材料重組人胰島素類似物(rhInsulinlispro)對照品及其注射液(HumalogTM)、B30脫蘇氨酸重組人胰島素由美國Elilly公司提供；重組人胰島素對照品、重組人胰島素-A21脫氨人胰島素對照品、豬胰島素-A21脫氨豬胰島素對照品、重組人胰島素類似物單體-二聚體對照品(中國藥品生物制品檢定所)；重組人胰島素為國產原料；V8蛋白酶為Sigma產品；乙腈為色譜純試劑，其它試劑均為國產分析純。

　　2、方法與結果

　　2.1 肽圖譜測定取重組人胰島素類似物對照品、重組人胰島素對照品和B30脫蘇氨酸重組人胰島素適量，用0.1%的CF3COOH溶液制成每1mL中含10mg的溶液；取20μL，加0.2mol.L-1Tris-鹽酸緩沖液(pH7.3)20μL，0.1%V8蛋白酶溶液20μL，水140μL，混勻，置37℃水浴2h后，加85%的磷酸溶液3μL終止反應，作為酶解樣品溶液；另取重組人胰島素類似物對照品、重組人胰島素對照品和B30脫蘇氨酸重組人胰島素適量，以水代替V8蛋白酶同法制備非酶解樣品溶液。采用Vydac Protein and Peptide C18色譜柱(250mm×4.6mm)；柱溫40℃；流速1.0mL.min-1；檢測波長214nm；以0.2mol.L-1硫酸鹽緩沖液(pH2.3)-乙腈(90∶10)為流動相A，乙腈-水(50∶50)為流動相B；進行梯度洗脫。初始狀態(tài)為10%B，5min時流動相B增至20%，45min時流動相B增至60%，保持5min。取上述酶解樣品溶液和非酶解樣品溶液各20μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

　　1. 重組人胰島素類似物酶解樣品

　　2. B30脫蘇氨酸重組人胰島素酶解樣品

　　3. 重組人胰島素酶解樣品

　　4. 重組人胰島素非酶解樣品

　　5. 重組人胰島素類似物非酶解樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ—人胰島素酶解片段代號

　2.2  RP-HPLC鑒別取重組人胰島素-A21脫氨人胰島素對照品、牛胰島素、豬胰島素-A21脫氨豬胰島素對照品和重組人胰島素類似物對照品適量，各用0.01mol.L-1鹽酸溶液分別制成每1mL中含2.8mg的溶液，取上述4種溶液等體積混合，制得混合樣品溶液；采用SpherisorbODSⅡ(100mm×4.6mm)色譜柱；流速0.8mL.min-1；柱溫40℃；檢測波長214nm；以0.2mol.L-1硫酸鹽緩沖液(pH2.3)-乙腈(75∶25)為流動相。分別取各種胰島素溶液和混合樣品溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，確定不同保留時間對應的成分。

　2.3  RP-HPLC分析重組人胰島素類似物及有關物質取A21脫氨人胰島素類似物對照品適量，用0.01mol.L-1鹽酸溶液制成每1mL中含3.5mg的溶液作為系統(tǒng)適用性樣品溶液；取重組人胰島素類似物注射液，用0.01mol.L-1鹽酸溶液調pH約為5.3時，其中重組人胰島素類似物形成白色沉淀，4000g離心10min，取上清液作為空白注射液；采用Vydac Protein and Peptide C18色譜柱(250mm×4.6mm)；柱溫40℃；流速1.0mL.min-1；檢測波長214nm；以0.2mol.L-1硫酸鹽緩沖液(pH2.3)-乙腈(82∶18)為流動相A；0.2mol.L-1硫酸鹽緩沖液(pH2.3)-乙腈(50∶50)為流動相B，洗脫梯度初始狀態(tài)流動相B為19%，保持60min，在23min內流動相B增至49%，保持5min。取上述樣品溶液和重組人胰島素類似物制劑空白各20μL注入液相色譜儀。

　2.4  HPSEC分析取重組人胰島素類似物原料、重組人胰島素類似物制劑、重組人胰島素類似物單體-二聚體對照品用流動相制成濃度為每1mL約含0.7mg(20U)的溶液。采用ZorbaxGF250Special(25cm×9.4mm)分析色譜柱；以0.1mol.L-1磷酸銨緩沖液(pH7.5)-乙腈(65∶35)為流動相；流速0.5mL.min-1；檢測波長214nm。取上述樣品溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

　　3、討論

　3.1 鑒別重組人胰島素類似物的分子結構如圖5所示。實驗中使用的V8蛋白酶能專一裂解谷氨酸的羧基端肽鍵。在非還原條件下，用V8酶水解重組人胰島素類似物分子，理論上可產生4個片段，即Ⅰ(A5-17與B1-13)、Ⅱ(A18-31與B14-21)、Ⅲ(B22-30)、Ⅳ(A1-4)。而在本實驗條件下，則多了一個中間片段，即Ⅴ(A1-17與B1-13)，這是片段Ⅰ和Ⅳ聚合的結果。人胰島素和B30脫蘇氨酸人胰島素以及重組人胰島素類似物的酶解片段Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ的保留時間是相同的，分別為1460、730、220和1600s，但片段Ⅲ的保留時間則有差別，分別為660和550以及630s。由此可見，通過肽圖譜分析鑒別胰島素類似物是非常有效的。由圖2可見，本文的RP-HPLC方法能有效地區(qū)分人、豬、牛胰島素和重組人胰島素類似物。此法快速、不受其它成分干擾。

　3.2 雜質分析重組人胰島素類似物在高溫高濕度條件下，易產生高分子量蛋白(HMWP)，如在40℃，75%相對濕度下，HMWP的增加速率為每天0.16%；而在酸性條件下，易形成脫氨產物，如其酸性溶液在室溫放置時，A21脫氨重組人胰島素類似物的增加速率為每天0.6%。本文據(jù)此制備系統(tǒng)適用性樣品，在RP-HPLC線性梯度洗脫分析中，重組人胰島素類似物與其A21脫氨產物的分離度為2.6，按重組人胰島素類似物峰計算，其理論塔板數(shù)為5350；而在HPSEC分析中，分離度以二聚體峰高與單體和二聚體間的峰谷高之比表示，其值應大于2.0，按重組人胰島素類似物單體峰計算，其理論塔板數(shù)為6200。

　　綜上所述，本文方法能有效地區(qū)分人、牛、豬胰島素與人胰島素類似物，能檢測分離人胰島素類似物及有關物質和高分子量蛋白。結果為該類藥物的質控提供了科學依據(jù)。